uji gram bakteri

PENDAHULUAN

Latar Belakang

Bakteri merupakan mikroorganisme prokariotik bersel tunggal, tidak berklorofil dan berkembang biak dengan cara membelah diri. Sebenarnya bakteri termasuk tanaman tetapi tidak berklorofil, tidak berplastida, dan bersel satu berukuran kurang lebih 0.0003-0.025 milimikron, dengan kemampuan berkembangbiak yang sangat tinggi. Bentuknya bermacam-macam ada yang bulat berupa kokus, diplokokus, streptokokus, tetrakokus dan stafilokokus. Batang berupa basilus, diplobasilus, dan streptobasilus, bulat panjang, koma dan spiral. Kulitnya lunak terdiri dari selulosa dan kitin seperti tanaman. Pada bakteri yang menimbulkan kerusakan pada benda-benda hidup dinamakan pathogen atau penyebab sakit. Bakteri pathogen umumnya hanya hidup dalam bentuk sel tubuhnya yang dapat masuk kedalam tubuh tanaman melalui luka-luka. Untuk bakteri yang memanfaatkan benda mati disebut bakteri saprofit yang bias mengeluarkan racun agar bias mengurangi benda tersebut menjadi humus, dan dimanfaatkan oleh tanaman hidup. Adapun bakteri yang kerjasama (simbiose) dengan tanaman adalah bakteri rhizobium yang membentukbintil-bintilakar (Moaledj, 1986).

Morfologi sel bakteri dapat diamati dengan dua cara yaitu:

1. pengamatan sel hidup yang tidak diwarnai

2. Pengamatan sel mati dan diwarnai. Bakteri yang hidup tidak berwarna sehingga sulit diamati. Bakteri dapat diwarnai tanpa mewarnai lingkungan sekitarnya

Cendawan bukanlah tumbuhan atau hewan. Cendawan tidak memiliki klorofil seperti tumbuhan sehingga tidak dapat melakukan fotosintesis dan menyimpan karbohidratnya dalam bentuk glikogen bukan pati seperti pada tumbuhan. Cendawan tidak menelan dan mengunyah makanan seperti pada hewan, melainkan merombak makanannya di luar tubuh secara enzimatik dan diserap melalui hifa. Cendawan termasuk makhluk hidup eukariotik karena sudah memiliki inti sel yang terbungkus membran. Hidupnya bersifat heterotrof dengan menggunakan bahan organik yang sudah tersedia. Bahan organik yang digunakan dapat berupa bahan organik mati (saprotrof) atau bahan organik hidup (simbiosis). Simbionsis dapat bersifat antagonistik dan mutualistik. Cendawan yang melakukan simbioisis antagonistik dapat menyebabkan penyakit parasitik yang merugikan makhluk hidup inangnya. Sebaliknya, cendawan yang membentuk simbiosis mutualistik menguntungkan baik inang maupun cendawannya itu sendiri. Inang untuk cendawan ialah tumbuhan, hewan, dan mikroorganisme termasuk cendawan (Sumarsih, 2003).

Miselium yang kebanyakan  pada  jamur adalah hialin (tidak berwarna). Jika berwarna, maka ini mempunyai pigmen yang menyebabkan warna kelam mirip dengan melanin yang kebanyakan terikat pada dinding sel. Hifa yang membentuk konidium atau yang melindungi alat-alat perkembangbiakan kebanyakan berwarna kelam. Pada prinsipnya hifa jamur dibedakan menjadi hifa senotisis (coenocytis) atau hifa tidak bersekat dan hifa seluler atau hifa bersekat. Hifa tidak bersekat terdapat pada jamur-jamur klas Phycomycetes dan hifa bersekat terdapat pada jamur-jamur klas Ascomycetes, Basidiomycetes dan Deuteromycetes (Sumarsih, 2003).

Tujuan

Tujuan praktikum ini adalah  untuk mengetahui cara uji gram serta mengetahui cara membedakan bakteri gram positif dan bakteri gram negatif.

TINJAUAN PUSTAKA

Pewarnaan gram atau metode gram adalah suatu metode empiris untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar yaitu Gram positif dan bakteri Gram negatif. Perbedaan klasifikasi antara kedua jenis bakteri ini terutama didasarkan pada perbedaan struktur, sifat kimia, dan fisik dinding sel bakteri. Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, seorang ilmuwan Denmark bernama Hans Christian Gram (1853–1938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella pneumoniae (Qiqi, 2008).

Melihat dan mengamati bakteri dalam keadaan hidup sangat sulit, kerena selain bakteri itu tidak berwarna juga transparan dan sangat kecil. Selain itu bakteri yang hidup akan kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri tersebut disuspensikan. Sedangkan, untuk mengatasi hal tersebut maka dikembangkan suatu teknik pewarnaan sel bakteri, sehingga sel dapat terlihat jelas dan mudah diamati. Oleh karena itu teknik pewarnaan sel bakteri ini merupakan salah satu cara yang paling utama dalam penelitian-penelitian mikrobiologi. Prinsip dasar dari pewarnaan ini adalah adanya ikatan ion antara komponen selular dari bakteri dengan senyawa aktif dari pewarna yang disebut kromogen. Terjadi ikatan ion karena adanya muatan listrik baik pada komponen seluler maupun pada pewarna. Berdasarkan adanya muatan ini maka dapat dibedakan pewarna asam dan pewarna basa. Teknik pewarnaan gram tersebut dapat menghasilkan warna merah dan ungu, bakteri gram negatif ditandai dengan pewarnaan merah sedangkan yang positif berwarna ungu  (Levine, 2000).

Karena pewarnaan Gram merupakan jenis pewarnaan bertingkat, maka terdapat tahapan-tahapan di dalam prosesnya. Sistem pewarnaan Gram dilaksanakan berdasarkan tahapan yang sudah ditentukan di dalam penggunaan pewarna ataupun pelunturnya. Secara singkat, pada proses ini olesan bakteri pada preparat yang terfiksasi secara berurutan dikenai larutan ungu kristal, cairan lugol, larutan alcohol (bahan pemucat) dan safranin atau beberapa pewarna tandingan lain yang sesuai. Pada proses ini juga digunakan aquades di sela-sela beberapa pewarnaan (Suriawiria, 2005).

Bakteri yang terwarnai dengan metode ini dibagi menjadi dua kelompok, yaitu bakteri Gram Positif dan Bakteri Gram Negatif. Bakteri Gram positif akan mempertahankan zat pewarna kristal violet dan karenanya akan tampak berwarna ungu tua di bawah mikroskop. Adapun bakteri gram negatif akan kehilangan zat pewarna kristal violet setelah dicuci dengan alkohol, dan sewaktu diberi zat pewarna tandingannya yaitu dengan zat pewarna air fuchsin atau safranin akan tampak berwarna merah. Perbedaan warna ini disebabkan oleh perbedaan dalam struktur kimiawi dinding selnya (Qiqi, 2008).

Ciri gram bakteri positif adalah struktur dinding selnya sederhana, tersusun atas peptidoglikan tanpa lapisan lipopolisakarida. Jika diberi pewamaan gram, bakteri gram positif akan berwarna ungu. Anggota bakteri gram positif banyak yang menyebabkan penyakit pada manusia, misalnya Streptococcus pneumoniae yang menyebabkan pneumonia (radang paru-paru). Bakteri gram positif banyak yang menghasilkan toksin, misalnya Clostridium botulinum. Toksin yang dihasilkan oleh bakteri C. botulinum sangat mematikan, satu gram toksin dapat membunuh lebih dari satu juta orang. Selain dapat menimbulkan penyakit dan menghasilkan racun, bakteri gram positif juga dapat menghasilkan bahan-bahan yang menguntungkan. Contohnya, antibiotik yang dihasilkan oleh bakteri dari kelompok Actinomycetes. Antibiotik membunuh bakteri-bakteri gram positif lainnya dengan cara mencegah bakteri tersebut membentuk protein. Proteobacteria merupakan filum terbesar dalam Kingdom Eubacteria. Semua Proteobacteria merupakan bakteri gram negatif. tetapi memiliki bentuk bermacam-macam (batang, bulat, dan spiral). Kebanyakan bergerak dengan flagella (Strober W, 2001).

Bakteri gram-positif adalah bakteri yang mempertahankan zat warna metil ungu sewaktu proses pewarnaan Gram. Bakteri jenis ini akan berwarna biru atau ungu di bawah mikroskop, sedangkan bakteri gram-negatif akan berwarna merah atau merah muda. Perbedaan klasifikasi antara kedua jenis bakteri ini terutama didasarkan pada perbedaan struktur dinding sel bakteri (Qiqi, 2008).

Bakteri gram-negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram-positif akan mempertahankan warna ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol, sementara bakteri gram-negatif tidak. Pada uji pewarnaan Gram, suatu pewarna penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metil ungu, yang membuat semua bakteri gram-negatif menjadi berwarna merah atau merah muda. Pengujian ini berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan struktur dinding sel mereka (Qiqi, 2008).

Banyak spesies bakteri gram-negatif yang bersifat patogen, yang berarti mereka berbahaya bagi organisme inang. Sifat patogen ini umumnya berkaitan dengan komponen tertentu pada dinding sel gram-negatif, terutama lapisan lipopolisakarida (dikenal juga dengan LPS atau endotoksin) (Qiqi, 2008).

Faktor-faktor penentu keberhasilan dalam pewarnaan mikroba tergantung pada fiksasi, peluntur warna, substrat, intensifikasi pewarnaan dan zat warna penutup (Suriawiria, 2005).

BAHAN DAN METODE

Bahan dan Alat

Bahan

Bahan yang digunakan adalah KOH, Safranine, Methylen blue, Bakteri Ralstonia solonacearum, Alkohol, Air bersih, Spritus dan Tissu.

Alat

Alat yang digunakan adalah Slide glass, Pipet tetes, Jarum ose, Mikroskop dan Lampu Bunsen.

     Tempat dan Waktu

Praktikum ini dilaksanakan di laboratorium Fitopatologi Fakultas Pertanian Universitas Lambung Mangkurat Banjarbaru. Pada hari Senin tanggal 9 Desember 2013 pukul 11.00-12.30 Wita.

Prosedur Kerja

Uji Gram Menggunakan KOH

Beberapa metode kerja yang dilaksanakan pada uji gram antara lain sebagai berikut:

1.    Menyiapkan alat dan bahan

2.    Mengambil KOH, teteskan diatas slide glass secukupnya.

3.    Mengambil bakteri Ralstonia solanacearum letakkan diatas slide glass.

4.    Mengaduk atau ratakan bakteri raostonia yang berada di atas slide glass.

5.    Melakukan pengamatan dengan cara sedikit mengangkat larutan dengan jarum ose lakukan secara berulang, apabila saat dilakukan pengamatan terdapat benang berarti gram negatif.

Uji Gram Menggunakan Pewarnaan Safranine Dan Methylen Blue

1.    Menyiapkan alat dan bahan yang akan digunakan.

2.    Meletakkan bakteri diatas slide glass

3.    Memanaskan bagian bawah slide glass diatas lampu bunsen 

4.    Menetesi dengan menggunakan methylen blue

5.    Diamkan 1 menit dan cuci dengan menggunakan air bersih mengalir dan keringkan dengan tissu.

6.    Kemudian tetesi kembali dengan menggunakan safranine dan diamkan selama 3 detik.

7.    Setelah itu cuci dengan menggunakan air bersih mengalir dan keringkan dengan tissu.

8.    Hilangkan warna dengan menggunkan alcohol, diamkan dengan tissue 30 detik kemudian cuci dengan air mengalir

9.    Melakukan pengamatan apabila warna ungu kebiru-biruan menunjukkan gram positif tetapi apabila menunjukkan warna merah menunjukkan gram negatif.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Hasil

Hasil dari praktikum yang telah dilakukan adalah:

Tabel 1.Uji Gram

No.	Gambar	Keterangan
1.		Pengambilan larutan KOH 3% dan Penetesan larutan KOH
2		Pengambilan bakteri.
3		Pengamatan untuk menentukan gram positif dan gram negatif
4		Pengambilan bakteri untuk pewarnaan

Tabel 1.Lanjutan

No.	Gambar	Keterangan
5		Peletakan bakteri pada slide glass
6		Memanaskan bakteri diatas lampu Bunsen
7		Meneteskan methylen blue pada slide glass
8		Mencuci slide glass

Tabel 1.Lanjutan

No.	Gambar	Keterangan
9		Meneteskan safranine pada slide glass
10		Pengamatan menunjukkan gram negative

Tabel 2. Hasil Pengamatan Uji Gram KOH 3% dan Uji Gram Dengan Menggunakan Methylen Blue dan safranine.

No	Sampel	Hasil Uji Gram KOH	Hasil Uji Gram Methylen Blue dan safranine
1	Isolate Bakteri	Gram Negatif	Gram Negatif

Pembahasan

Uji gram merupakan suatu uji untuk mengetahui perbedaan antara gram negatif dam gram positif. Dari hasil praktikum uji Gram dengan KOH yang  telah dilakukan dengan mengunakan isolate bakteri

Dalam praktikum, langkah-langkah yang dilakukan untuk uji gram yaitu pertama-tama inokolum bakteri  diambil mengunakan jarum ose, inokolum bakteri yang digunakan yaitu bakteri Ralstonia solanacearum dan letakan pada tetesan larutan KOH 3%. Inokolum diaduk selama 5-10 detik dan kemudian jarum ose diangkat ke atas dari tetesan tadi. Bila larutan KOH menjadi kental dan cairan mengikuti jarum ose sampai 0,5-2 cm saat jarum ose diangkat, hal ini menunjukan bakteri yang diperiksa adalah gram negatif, sebaliknya bila cairan tidak mengikuti jarum ose maka bakteri yang diperiksa gram positif.

Setelah dilakukannya pengamatan pada praktikum yang kami lakukan ternyata larutan kental mengikuti jarum ose, dan pada saat diangkat terdapat benang-benang hifa, hal ini menunjukkan bahwa pada uji gram menggunakan bakteri Ralstonia solanacearum merupakan gram negatif.

Pada pewarnaan uji gram dengan menggunakan methylen blue dan safranine yang dilakukan yaitu meletakkan bakteri di atas slide glass, slide glass dipanaskan di atas lampu bunsen pada bagian bawahnya kemudian tetesi dengan menggunakan methylen blue dan diamkan 1 menit, cuci dengan menggunakan air bersih mengalir dan keringkan dengan tissu. Setelah itu tetesi kembali dengan menggunakan safranine dan diamkan selama 3 detik, cuci kembali  dengan menggunakan air bersih mengalir dan keringkan dengan tissu, langkah selanjutnya lakukan pengamatan apabila warna ungu kebiru-biruan menunjukkan gram positif tetapi apabila menunjukkan warna merah menunjukkan gram negatif.

Pada percobaan yang dilakukan pada bakteri yang diberi pewarnaan dengan menggunakan methylen blue dan safranine menunjukkan warna merah sehingga dapat disimpulkan bahwa bakteri menunjukkan gram negatif.

Pada gram positif dan negatif mempunyai perbedaan yaitu :

1.    Pada komposisi dinding sel gram positif kandungan lipidnya rendah      sedangkan pada gram negatifnya lipid.

2.    Pada gram positif  ketahanan terhadap penisilin lebih sensitif sedangkan gram negatif   lebih tahan.

3.    Pada gram positif penghambatan warna basa lebih dihambat  sedangkan pada gram negatif kurang dihambat.

4.    Gram positif kebutuhan nutrien     kompleks         sedangkan gram negatif relatif sederhana.

5.    Pada gram positif ketahanan terhadap perlakuan fisik      lebih tahan sedangkan pada gram negatif kurang tahan.

Karakteristik dari gram positif dan gram negatif yaitu

Karakteristik	Gram positif	Gram negatif
Dinding sel	Homogen dan tebal (20-80 nm0 serta sebagian besar tersusun dari peptidoglikan. Polisakarida lain dan asam teikoat dapat ikut menyusun dinding sel.	Peptidoglikan (2-7 nm) di antara membran dam dan luar, serta adanya membran luar (7-8 nm tebalnya) yang terdii dari lipid, protein, dan lipopolisakarida
Bentuk sel	Bulat, batang atau filamen	Bulat, oval, batang lurus atau melingkar seprti tand koma, heliks atau filamen; beberapa mempunyai selubung atau kapsul
Reproduksi	Pembelahan biner	Pembelahan biner, kadang-kadang pertunasan
Metabolisme	Kemoorganoheterotrof	Fototrof, kemolitoautotrof, atau kemoorganoheterotrof
Motilitas	Kebanyakan nonmotil, bila motil tipe flagelanya adalah petritrikus (petritrichous)	Motil atau nonmotil. Bentuk flagela dapat bervariasi-polar,lopotrikus (lophtrichous), petritrikus (petritrichous).
Anggota tubuh (apendase)	Biasanya tidak memiliki apendase	Dapat memiliki pili, fimbriae, tangkai
Endospora	Beberapa grup dapat membentuk endspora	Tidak dapat membentuk endospora

           

KESIMPULAN

            Kesimpulan yang dapat diperoleh dari praktikum yang telah dilakukan adalah sebagai berikut:

1.    Uji gram merupakan suatu uji untuk mengetahui perbedaan antara gram negatif dam gram positif.

2.    Dalam uji gram KOH sebanyak 3 % bila larutan KOH menjadi kental dan cairan mengikuti jarum ose sampai 0,5-2 cm saat jarum ose diangkat, hal ini menunjukan bakteri yang diperiksa adalah gram negatif, sebaliknya bila cairan tidak mengikuti jarum ose maka bakteri yang diperiksa gram positif.

3.    Pada praktikum cairan kental bakteri mengikuti jarum ose dan terlihat seperti ada benang atau hifa berarti menunjukkan gram negatif.

4.    Dalam uji pewarnaan dengan menggunakan methylen blue dan safranine apabila warna ungu kebiru-biruan menunjukkan gram positif tetapi apabila menunjukkan warna merah menunjukkan gram negatif.

5.    Pada percobaan yang dilakukan pada bakteri yang diberi pewarnaan dengan menggunakan methylen blue dan safranine menunjukkan warna merah sehingga dapat disimpulkan bahwa bakteri menunjukkan gram negatif.

DAFTAR PUSTAKA

Levine, M. 2000. An Introduction to Laboratory Technique in Bacteriology. McMillan Company, New York.

Moaledj, K. 1986. Comparison of Gram-staining and alternate methods, KOH test and aminopeptidase activity in aquatic bacteria: their sapplication to numerical taxonomy. Journal of Microbiological Methods, Vol 5, p. 303-310.

Qiqi. 2008. Kumpulan Hasil-hasil Penelitian Mikroba. Pusat Penelitian Mahluk Hidup. Jakarta.

Strober W. 2001. Pemantauan Pertumbuhan Sel. In Coligan JE, Bierer.

Sumarsih, Sri. 2003. Mikirobiologi Dasar. Jurusan Ilmu Tanah Fakultas Pertanian UPN “Veteran” Yogyakarta.

Suriawiria, U. 2005. Mikrobiologi Dasar. Papas Sinar Sinanti, Jakarta.